實驗操作時間:5/15(六) 操作實驗室:涵青老師實驗室
目標:
將pET28b中的EGFP clone到pET24a中，操作過程參考生物核心技術實驗。
問題:
●原先是想和核心技術實驗的內容相反*1，將EGFP clone到TA vector中，但後來確定TA vector中其實沒有我們使用的restriction enzyme NedI 的校切位，跟助教研究了一下才換成用pET24a。至於核心實驗中的TA vector中的NedI 校切位究竟怎麼來的，就不得而知了。但我猜應該是在把EGFP塞進TA vector的時候才一起塞進去的。
●本次做膠時使用的不是safe dye而是使用靈敏度較高，但也較危險的EtBr。操作過程需配戴特定手套，但是還是經常用一般的手套去摸到EtBr的專用操作台。對危險物品的危機意識有點太低，之後要多注意。
●跑膠確定plasmid是否有切對的時候，marker其實沒有跑得很開，10k和8k的bond幾乎黏在一起，之後可以考慮讓他跑久一點*2。
●Transform結束後拿去養菌*316個小時但是沒有任何一顆菌長出來，我們想可能時這次用的competent cell是handmade 因此transform效率沒有公司做得那麼好，所以沒transform成功。
備註:
*1:核心實驗中是從TA vector中取出EGFP再放到pET28b中，而本次操作是從pET28b拿出EGFP。
*2:本次跑膠時間是25分鐘，電壓125V，loading dye 跑到倒數第三格。
*3:transform進DH5α，培養基是放Kanamycin當抗生素
結果:
左圖是enzyme digestion之後的膠圖，接著要切膠純化出所需片段，左邊的well是pET24a理論上要是5264bp，在圖中介於6k和5k之間(第一個要切膠純化的部分)。右邊的well上面較亮的是切剩下的pET28b，在1k下面一點點的是EGFP(750bp)的band(第二個要切膠純化的部分)。
(圖片來源:本人拍攝)
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左圖是colony PCR之後的膠圖，由上往下第一條亮帶是1000kb，而我們這次PCR primer夾的長度，扣掉Ndel和EcoRl之間的長度再加上EGFP的750bp差不多就在1000bp左右。所以可以確定裡面的vector和insert有結合成功。
(圖片來源:本人拍攝)
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心得:
(5/15)這次操作主要讓自己練習各個動作，以及嘗試了許多在核心技術實驗不會用到的東西和不會碰到的問題。同時也在這次的操作發現自己對整天做實驗這件事不排斥，甚至沒有注意到時間已經過很久了。最後就是要努力克服不喜歡開火這件事。
(6/6)今天主要是從ligation繼續，因為上次已經操作過一次，因此基本上沒有太大的問題。做colony PCR時也沒有問題，因為在做核心技術實驗時就有跟助教學要如何操作PCR儀器。只是當我跑完PCR再次去跑膠確認夾出片段是否正確時。這一切過程都很順利，包含用EtBr做膠時也是。而幸運的是也獲得我們想要的結果，於此同時一陣空虛向我襲來。起初想不出原因，理論上做出結果應該要很開心，卻是過程中讓我覺得很滿足，結果讓人覺得結束得有點突然。後來仔細想一想，可能時因為這一個結果並沒有解決任何問題，而是過程中我學習到許多做實驗需要注意的地方跟技巧。
